采用高压液相色谱库仑阵列电化学检测器分析四环素类抗生素 （Analysis of Tetracyclines by High-Performance Liquid Chromatography with a Coulometric Electrode Array System）

   作者:赵福年

   关键词:高效液相色谱； 四环素； 抗生素；电化学检测器；牛奶

   摘要:本文建立了利用高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器（HPLC-ECD）对四环素类抗生素（TCs）进行检测的方法。同时对样品的前处理、流动相的条件以及电极电势的选择进行了研究，确定最佳的检测条件。在最佳条件下，对盐酸土霉素片、盐酸四环素片进行了分析；还对牛奶中四环素类抗生素的残留进行了分析。 分析中，采用的色谱柱为C18 柱(150mm×4mm i.d.， 5mm)。色谱使用C18柱(150mm×4mm ，i.d.)。流动相条件为：0.05M磷酸二氢钠水溶液-乙腈（78:22,v/v），其中盐溶液中加入0.5%三乙胺，并用磷酸调节pH为2.2。流动相流速：1mL/min。四组电极用于检测，其电压分别为400, 660, 680,和700mV。 盐酸土霉素片和盐酸四环素片利用0.01M盐酸溶解，经0.22mm膜过滤后可直接用于HPLC-ECD分析。牛奶样品首先用1M的盐酸调pH 4.0，然后进行液液萃取，利用乙腈、正己烷去除牛奶中的蛋白质、脂肪等杂质，经0.22mm膜过滤后可用于HPLC-ECD分析。 研究发现，在最佳条件下，对处理后的样品进行检测，定性分析重现性高、灵敏、经济、快速。定量分析线性度高、标准偏差小。而且在对牛奶中四环素类抗生素残量的分析时，其最低检测限低于欧美国家法规中规定的最大残留量，可应用于牛奶质量的日常监控。 

 胸腺五肽和扶素康的固相合成及纯化 （Solid-phase Synthesis and purification for Thymopentin &Fusukang）

   作者:张成刚

   关键词:固相合成，胸腺五肽，扶素康，离子交换层析，反相高效液相层析 

   摘要:本文首先研究了胸腺五肽的Fmoc法固相合成及分离纯化，固相合成中系统地研究了缩合时间、反应溶剂、缩合剂和树脂切割条件对合成质量的影响，确立了最优的工艺条件为：以DMF为反应溶剂，HATU为缩合剂，TFA:p-甲基苯酚:EDT:水为97:0.25:0.25:2.5(V/V)的切割条件，2倍过量进行缩合反应，反应时间为3h。反应结果胸腺五肽纯度达80.36%，收率达79.68%；应用RP-HPLC法定量反应物中的Fmoc氨基酸来监控反应进程；通过对胸腺五肽粗品的分离纯化研究，确立了纯化工艺为：先用离子交换层析进行初步纯化，纯化后产品的纯度提高到90%，收率达85%；再以反相高效液相制备层析进行最终纯化。最终纯化结果纯度达到98%。两步纯化的总收率为68%。 此外，还研究了扶素康的Fmoc法固相合成及分离纯化，考察了缩合剂、缩合时间和洗涤方式对合成质量的影响，确立了最优合成工艺条件为：以HATU为缩合剂，缩合及脱保护完成后以DCM洗涤5次，各氨基酸按适当的过量倍数及缩合反应时间进行固相合成。反应结果扶素康纯度达32.30%，收率达21.02%；通过对扶素康粗品的分离纯化研究，确立了纯化工艺路线为：先用离子交换层析进行初步纯化。经层析后产品的纯度提高到78%，收率为55%；再以反相高效液相制备层析进行最终纯化。最终纯化结果纯度达95%。两步纯化的总收率为33%。 

 胸腺素a1和抗SARS八肽的化学合成与分离纯化 （Chemical synthesis, separation and purification of thymosin a1 and anti-SARS octapeptide）

   作者:黄永东

   关键词:胸腺素a1和抗SARS八肽的化学合成与分离纯化

   摘要:本文系统研究了不同缩合剂对固相化学合成胸腺素a1的影响，并对其合成工艺和分离纯化工艺进行优化。最佳的合成工艺为：以HBTU为缩合剂，以2-4当量的试剂（前11个氨基酸为2当量，后续的为4当量），平均11h/氨基酸的缩合速度化学合成胸腺素a1；缩合后和脱保护后的洗涤次数均以6次为宜。该条件下合成的胸腺素a1的粗品收率为89.9%，纯度为31.2%，目标物胸腺素a1的收率为28.0%，单位成本为2.49 RMB/mg胸腺素a1。分离纯化工艺为：首先以离子交换层析法对胸腺素a1粗品进行初步的分离纯化，以除去粗品中大量的杂质。采用DEAE Sepharose Fast Flow填料，pH5.8的0.02mol/L磷酸钠缓冲液以及pH5.8的0.5mol/L氯化钠和0.02mol/L磷酸钠缓冲液，上样量为50mg。经层析后产品的纯度提高到75%，收率为60%。然后以反相高效液相层析法对胸腺素a1进行最终的纯化。采用C18柱，以0.1%TTA为离子对试剂，乙腈线性梯度洗脱，上样量为50mg。反相层析后产品的纯度达到95%，收率为60%。两步纯化的总收率为36%，纯度符合要求，纯化规模达到半制备水平，为胸腺素a1的工业化奠定了基础。此外，还首次K. C. Chou等筛选的抗SARS八肽进行了探索和研究，着重考察了不同的缩合剂和缩合时间对化学合成抗SARS八肽的影响，建立八肽的合成工艺和分离纯化工艺。其最佳的合成工艺为：以HBTU为缩合剂，以2当量的试剂，平均5 h/氨基酸的缩合速度化学合成八肽。该条件下合成的八肽的粗品收率为87.6%，纯度为72.8%，目标物八肽的收率为63.8%，单位成本为1.23RMB/mg八肽。其分离纯化工艺为：以制备型RP-HPLC对八肽进行分离纯化，采用C18柱，以0.1%TFA为离子对试剂，乙腈线性梯度洗脱，上样量为10mg。反相层析后产品的纯度达到95%，符合对纯度的要求，收率为65%。活性测定结果表明八肽对SARS病毒有很强的抑制作用，具有开发为治疗SARS的多肽药物的前景。 

 利培酮片的质量研究与技术标准制定（QUALITY STUDY AND QUALITY CONTROL OF RESPERIDONE TABLETS）

   作者:王萍

   关键词:利培酮片，抗精神病药，高效液相色谱，质量标准，含量测定，溶出度 

   摘要:利培酮片是新一代的抗精神病药物制剂。适用于急性和慢性精神分裂症以及其它各种精神病性状态明显的阳性症状和阴性症状的治疗。该药由比利时杨森制药公司研制开发，目前在国内由西安杨森制药有限公司独家生产。与经典的抗精神病药物相比，其临床疗效好，副作用小，能显著提高病患者的生活质量。 为给患者高质量的药品，对于药品的质量控制，生产厂有责任建立完善的质量标准体系。鉴于目前利培酮片的分析方法的缺陷，本文对该药相关的文献资料进行了详细分析研究，旨在建立一套科学的、完善的分析方法，以确保利培酮片的质量可控。 本文运用当代药物分析领域的先进手段-高效液相色谱法，通过实验，分别建立了梯度洗脱高效液相色谱法和等度洗脱高效液相色谱法，前者同时用于利培酮片中活性成分的鉴别、含量测定、含量均匀度测定及有关物质测定，后者用于利培酮片的溶出度测定。并按照ICH指导原则的要求，对这两个分析方法进行了完整的方法学研究和方法验证。 研究结果表明，所开发的套分析方法均克服了现行标准中分析方法的缺点，并且专属性强，准确度、精密度、重复性、重现性及通用性都非常好，能真实地反映产品质量，同时操作简便，利于推广，适宜作为利培酮片的质量控制方法。

 质粒DNA发酵与分离纯化过程的研究（Studies on Fermentation and Purification Processes of plasmid DNA）

   作者:黄慧

   关键词:质粒；发酵；流加；碱裂解；阴离子交换层析

   摘要:本论文以含有质粒pcDNA3的E. coli DH5α菌株为对象，系统地研究了从发酵到细胞裂解，再到阴离子交换色谱纯化的质粒大规模制备过程。 首先在摇瓶中进行的正交试验用以考察选定因素以及每个因素的各个水平对质粒菌发酵中菌体浓度的影响程度。根据实验结果选取利于质粒菌高密度发酵的最优化条件进行质粒的生产。同时进行了大肠杆菌生长曲线的测定和质粒小量制备纯化及含量测定的实验，以研究该质粒在发酵液中含量同宿主菌生长曲线的关系，找出收获质粒的最佳时间。 然后重点研究了含有质粒pcDNA3的大肠杆菌E. coli DH5α在发酵罐中的高密度发酵。分别详细考察了间歇发酵和流加发酵过程。研究了包括菌体生长和质粒含量等的关系。 最后用碱裂解法裂解细胞提取质粒，并将提取物进行阴离子交换层析以进一步纯化质粒。通过改变层析条件，例如阴离子交换固定相，流动相组成，洗脱方法，上样量等，得到不同的洗脱结果，最终确定阴离子交换色谱纯化质粒的理想操作条件。 

 液相色谱-电化学检测器测定生物样品中的痕量 β2-受体激动剂（Detection of β2-agonists residue in biological samples by HPLC with electrochemical detection）

   作者:张雪竹

   关键词:液相色谱；电化学检测器；固相萃取；沙丁胺醇；盐酸克伦特罗 

   摘要:本文利用液相色谱-库仑阵列电化学检测器（HPLC-ECD）对人血浆和尿液中的沙丁胺醇和猪肝中残留的盐酸克伦特罗两个β2-受体激动剂的检测进行了系统研究。通过对样品提取方法、流动相组成和pH、检测电势等因素的实验研究，确定了血浆及尿液中沙丁胺醇和猪肝中的盐酸克伦特罗的检测条件。 首先将人血浆或尿液通过硅胶固相萃取柱，以分离富集其中的沙丁胺醇。然后用液相色谱-电化学检测器检测固相萃取柱的洗脱液。液相色谱的流动相为30mmol/L磷酸二氢钠水溶液:甲醇=90:10（其中水溶液中加入0.4% 三乙胺，并用20%磷酸调pH至6.0）；四组电极的检测电势分别为300mV、400mV、550mV和650mV。在此条件下，血浆和尿样中的沙丁胺醇的回收率分别为77.32%和81.25%；检测限分别为 0.5ng/mL和2.5ng/mL。 此外，又将含有盐酸克伦特罗的猪肝用匀浆机匀浆，用1mol/L盐酸溶出其中的盐酸克伦特罗，再用乙醚去除盐酸溶出液中的脂肪后，用2mol/L氢氧化钠调节溶出液pH为11.6，用乙醚萃取其中的克伦特罗。液相色谱的流动相A为50mmol/L磷酸-30mmol/L 三乙胺，并用2mol/L氢氧化钠调 pH至4.0；流动相B为甲醇:乙腈=30:45（v/v）；流动相组成为A:B=80:20。四组电极的检测电势分别为450mV、600mV、650mV和680mV。在此条件下，猪肝中盐酸克伦特罗的萃取回收率为78%；检测限为1.2 ng/g。 另外，本文对所建立的方法均进行了周密的验证，结果显示两个方法都准确、灵敏，适宜生物样品的检测。 

 基因重组白细胞介素－11发酵工艺及纯化工艺研究 （Studies on fermentation of recombinant E.coli containing gene of IL-11 and purification of IL-11）

   作者:赵凯利 

   关键词:蛋白质构象变化,活性中心模型,甲硫氨酸氨基肽酶-2,计算机辅助抑制剂设计

   摘要:人白细胞介素-11,融合蛋白,发酵,重组大肠杆菌 
中文文摘 本文系统的研究了重组大肠秆菌表达白细胞介素－11（lL－11）融合蛋白的发酵工艺条件。摇瓶实验中，确定了以Mg培养基为最佳高密度发酵培养基。同时，对诱导剂进行优化，采用0．005g／L的IPTG就能有效的诱导外源基因表达，大大节约了成本。在10L发酵罐中，采用了流加方式进行了高密度发酵。尝试了两种培养基：一种是以葡萄糖为主要碳源，另一种是以甘油为主要碳源。得到最佳发酵条件为；温度30度；诱导前pH为6．8－7．0，诱导后为7．2；在OD_（600）为15左右时诱导，诱导后3．5个小时结束发酵。在以葡萄糖为主要碳源时，可得菌体湿重65g/L，干重8．4g/L, 表达量为18％；在以甘油为主要碳源时，可得菌体湿重80g/L,干重9．2g/L，表达量为22。同时，采用了人工神经网络预测菌体生长曲线，有利于培养条件的确定。本文还详细的研究了白细胞介素－11融合蛋白的亲和纯化工艺，主要涉及菌体破碎、平衡缓冲液对融合蛋白IL－11吸附的影响和融合蛋白IL-11的洗脱条件优化等，经纯化后，IL－11的纯度达80％，回收率达80％。

 固相合成抗爱滋病多肽药物－扶素康工艺的初步研究 （Preliminary study on solid phase peptide synthesis process of FUSUKANG for AIDS）

   作者:戴琦

   关键词:扶素康,固相多肽合成,DCC/DIC-HOBt,高效液相色谱 

   摘要:初步确立了抗艾滋病多肽药物扶素康的固相合成方案。利用多肽合成技术，采用对碱敏感的N~ alpha -芴甲氧羰基（Fmoc）作为 alpha -氨基的保护基，以DCC／DIC－HOBt为缩合剂，50％哌啶／DCM为脱保护试剂，以逐个延伸的口相合成法合成了36个残基的扶素康多肽序列。结果表明该方法反应条件温和，操作简便，易于实现自动化。扶素康手动合成粗肽产品收率40.6％。 对扶素康自动合成过程与手动合成过程进行了对比。自动合成过程速率快，扶素康粗产品合成收率38．1％。自动合成法成本高，过程缺乏灵活性，不适于作为扶素康的合成生产方案。但在扶素康手动合成过程中可灵活借鉴自动合成的一些优点，采用更高效的缩合剂，适当增大反应物过量计量，改善树脂的传质，提高扶素康手动合成的效率。首次建立了合成扶素康粗产品的HPLC分析方法。考察了合成扶素康粗产品在不同条件下HPLC行为，研究了乙腈浓度梯度、乙睛起始浓度和流动相流速对分析效果的影响。结果表明，扶素康粗产品的分离度对流动相中乙睛的浓度非常敏感，乙睛的起始浓度对分析结果也会造成一定影响。在本文研究范围内，流动相流速对扶素康粗产品的分析结果影响不显著。 

 不同相态二氧化碳对微生物生理活性的影响 （Effect of Carbon Dioxide in Different Phases on Physiological Properties for Microorganisms）

   作者:刘秀凤

   关键词:超临界二氧化碳 非水溶剂 微生物细胞生理特性

   摘要:超临界二氧化碳作为一种环境友好的非水溶剂，在生物与化学品制备、微生物细胞培养与底物转化过程中有非常广泛的应用前景。为了使超临界二氧化碳用于有活细胞的生物转化过程，首先需要充分认识微生物细胞在其中的生命活动规律和主要的影响因素，把握各种影响因素的相互协调作用。但目前相关的研究报道相当有限，对二氧化碳溶剂与细胞的相互作用机理缺乏了解。本文以啤酒酵母和蓝色梨头霉两类菌种为研究对象，首先研究了常规条件下蓝色梨头霉菌丝球的生理活性和生长代谢规律，确定了初始pH值的适宜范围是6．5—7.0、转化过程中的适宜pH值约为6．5。此外还确定了菌丝培养的诱导时间、最佳培养基组成和转化条件等。从实验测定、形态观测和理论分析等不同角度系统研究加压二氧化碳环境中微生物细胞的存活状况与生理性质变化，涉及到的影响因素包括：压力、升降压速度、温度、暴露时间、含水量和 pH值等。综合分析结果表明，各种影响因素之间相互协同，其在不同相态二氧化碳中发挥作用的强弱程度差别颇大，并以超临界二氧化碳中的影响程度最为显著。微生物细胞在加压二氧化碳环境中的最佳pH随系统压力的提高、暴露时间的延长而上升。可以通过调整初始pH值或在实际代谢过程中随时调节pH的办法，改善二氧化碳溶剂中微生物的存活率，实现超临界二氧化碳在微生物培养和底物转化中的应用。 

 基于冗余PDB记录的蛋白质构象变化研究极其在Metap-2抑制剂设计中的初步应用（Studies on protein Conformational Change Based on the Redundant PDB Entries and Its Preliminary Application on Computer-aided Inhibitor Design of Metap-2）

   作者:王明涛

   关键词:蛋白质构象变化,活性中心模型,甲硫氨酸氨基肽酶-2,计算机辅助抑制剂设计

   摘要:本文通过对蛋白质三维结构数据库PDB中冗余记录的分析，提出一种将蛋白质残基运动转化成空间散点的分布形态，从而对蛋白质构象变化进行研究的方法，并利用该方法对甲硫氨酸氨基肽酶一2的构象变化进行了研究。从 PDB数据库中选取 10个冗余蛋白质家族，每个家族含 10个记录。对每一家族，分别用主链 alpha -碳（C_ alpha ）和侧链功能原子的原子坐标代表残基的空间位置，将每个残基的运动转化为10个空间散点的分布形态。利用主成成分分析方法对残基运动维数的研究表明，残基运动主要为一维和二维。对比运动幅度与二级结构信息，发现残基运动与其所属的二级结构单元具有一定的关联。定义了残基的折叠半径，发现酶的催化部位一般存在于运动幅度和折叠半径的“双极小值”处，利用该发现可对酶的催化部位进行预测。对结合部位和催化部位残基运动幅度的分析表明，催化部位的残基处于相对静止的状态，结合部位残基的运动幅度可能 出现在极大值、极小值和中间值处。据此，认为酶的活性中心是刚性与柔性的统一体，催化部位具有相对的刚性，结合部位具有相对的柔性。利用提出的方法对甲硫氨酸氨基肽酶一2的构象变化进行了研究，并对该酶抑．制剂的计算机辅助设计进行了初步探讨。利用三维结构数据库搜寻的方法对NCI数据库进行了搜索，得到了4种命中结构，为后续实验工作打下了基础。

  反相高效液相色谱用于重组人干扰素 alpha-2b 的分析研究（Studies on the RP-HPLC for rhIFN alpha-2b analysis）  

   作者:雷鸣

   关键词:蛋白质,定量分析,反相高效液相色谱,肽图

   摘要:反相高效派相色谱（RP－HPLC）是蛋白质分析、分离的有效手段，既可以用于蛋白质的定性分析，又可以用于蛋白质的定量测量。本文以标准物系牛血清白蛋白和人血清白蛋白以及真实物系重组人干扰素 alpha －Zb（IFN alpha -2b）为研究对象，分别采用 Lowry法 G-250法和反相高效液相色谱（RP-HPLC）法进行定量测量，经过分析比较，以研究RP－HPLC在蛋白质定量检测领域中的应用。研究表明：这三种方法中，RP－HPLC法的标准曲线线性关系最好；在实验方法重复性和准确性方面，一天内重复5次测定了同一浓度的标准蛋白质溶液，得到的结果中RP－HPLC的变异系数最小，即重复性最好，而G－250法最差。本 文还根据基因工程产品生产的实际工艺流程中可能引进的干扰物，设定了干扰物系： belta －ME、尿素、TriS－HCI、(NH4)_2SO_4、乙醇等，分别研究了当上述干扰物存在的情况下，对三种方法的干扰，并深入分析了各种干扰物产生干扰的原因。发现RP－HPLC法由于其本身的洗脱特点，在蛋白质定量中基本不受干扰。Lowry法的干扰试剂最多，G－250法居中。本文还对 RP－HPLC用于 IFN alpha －2b胰蛋白酶酶切肽图分析的条件进行了研究，通过摸索最佳裂解时间、最适宜的 IFN alpha －2b浓度和梯度洗脱条件，建立起对IFN alpha －2b进行肽图分析的最佳方法。目前由于各种原因，用于IFN alpha －2b的肽图分析方法未见其他文献报道，而为本实验提供 IFN alpha －2b的天津华立达生物制品有限公司至今未能建立起IFN alpha －2b酶切肽图的分析方法，因此本文的研究工作对该公司及其他重组人蛋白质的生产厂家在工艺和质量控制方面具有一定的指导意义和较强的实用价值。

  重组人白细胞介素-6中试纯化工艺研究  

   作者:章刚

   关键词:基因重组人白细胞介素-6　纯化工艺　二步层析　回收处理　包含体　产业化　　

   摘要:该文对基因重组人白细胞介素-6(rhIL-6)的纯化工艺进行了产业化研究.含有rhIL-6基因的工程菌经培养、诱导表达后,离心分离得到菌体,所得菌体经破碎、离心分离、纯化处理后得到的包含体,即为纯化过程的初始原料.分别研究了包含体的溶解变性体系,得到溶解效果较好的两种溶液体系.考察了超滤分级分离、离子交换层析、凝胶过滤、和疏水相互作用层析等分离方法,对IL-6的初步纯化效果,确定以阴离子交换层析作为初始纯化步骤,疏水相互作用层析与之衔接的纯化方案.研究了通过对二步层析(Q-Sepharose Fastflow)穿透液的回收处理增加rhIL-6收率的效果.

  Triangle open (1-9)ala~10 人白细胞介素11衍生物的重组与表达（Triangle open (1-9)ala~10 recombination and expression of human interleukin-11 derivative） 

   作者:聂李亚

   关键词:人重组白细胞介素11,大肠杆菌,多聚酶链式反应,蛋白结构

   摘要:人重组白细胞介素11,大肠杆菌,多聚酶链式反应,蛋白结构
中文文摘 本研究进行了蛋白结构模拟实验，发现天然IL－11N端 9个氨基酸的去除不但不影响其二级结构，且有增加功能基团暴露的作用。缺失N末端9个氨基酸后，重组表达及纯化的蛋白经测定其活性不低于天然IL－11。IL－11分子为强碱性蛋白，等点电大于10，且大量试验结果表明只有融合形式力能使之在大肠杆菌系统中表达。本研究选用了成本较低的pGEX-4T-1表达系统，但该系统表达的产物经凝血酶切后，会在 N末端留下 Ala－ser。天然人 IL-11分子的 N木端第 10位，11位是Val与Ser与其同源性很高的猿IL－11分子的 N木端第10位，11位是Ala，Ser，于是把天然IL一11的 N末端的 9个氨基酸去除，第 10位的 Val换为 猿IL-11的Ala，并把该片段连到GST系统上获得了重组工程菌pEEX一11／JM105。目的蛋白的表达，纯化及多方面的试验验证。说明本研究对IL-11的改造是可行的。

  固相合成胸腺素alpha1纯化工艺研究（Study on purification of the solid-phase synthetic thymosin alpha1） 

   作者:万里鹏  

   关键词:胸腺素alpha,固相合成多肽,离子交换层析,反相高效液相层析

   摘要:中文文摘 本文对固相合成的胸腺素#alpha#1的纯化工艺进行了研究，提出了一条合理的纯化路线。以N~#alpha~—甲氧骛羰基(Fmoc)作为#alpha#-氨基瞬时保护基，固相合成了胸腺素#alpha#1，胸腺素#alpha#1粗品的产率为73．69％。用反相高效液相层析(RP—HPLC)对胸腺素#alpha#1的粗品进行分析，纯度达到28．4％。采用两步纯化路线：第一步采用DEAE Sepharose Fast Flow为介质进行离子交换层析(IEC)。通过这一步后，除去了胸腺素#alpha#1粗品中的大部分杂质，使产品的纯度达到了65％以上，收率可达54％。第二步采用制备型RP-HPLC，用C18色谱柱对产品进行终纯化，产品的纯度达到95％以上，收率可达60％。经过两步纯化后，产品的纯度达到95％以上，总收率为32％。提出了适合于小分子多肤电泳分析的SDS—PAGE方法。终产品在SDS-PAGE和等电点聚焦电泳中呈现单一条带。采用E。玫瑰花结实验和淋巴细胞转化实验对产品的活性进行了检测，产品的活性达到了要求。纯化规模的放大，有待于进一步的研究。

  亲和层析树脂Ni-NTA Agarose 的制备及其对基因重组人脑钠素的纯化研究

   作者:蔡友庆  

   关键词:固定化金属离子层析介质,亲和纯化,NTA配基 　

   摘要:本文利用N—#epsilon#—苄氧羰基—L—赖氨酸和溴乙酸成功的合成了新型的亲和配基一N-(5—胺基-1—羧戊基)亚胺二乙酸（NTA)，通过将其偶联于表氯醇活化的SepharoseCL—6B上制备出NTA型固定化金属离子亲和层析(MAC)的亲和吸附介质，并利用自制的亲和吸附介质对融合有亲和标记6×His的基因重组人脑钠素(rhBNP)纯化工艺进行初步的研究。NTA配基的制备过程中，利用’H—NMR、FT—IR以及RP—HPLC三种方法对其结构和纯度的测定表明：采用二次冰浴法可将N—(5—苄氧羰基-氨基—1—羧戊基)亚胺二乙酸的产率提高到78％，纯度达90％；活化反应中，以二甲基亚砜(DMS0)为溶剂，采用分批加料方式操作，活化度可达90#mu#mol／g．gel。活化的胶体与NTA偶联后所得产品的N元素含量为1．17％，相应的配基密度为32．9#mu#lmol／g drained gel，与Qiagen公司的同类产品NTA agarose基本相同。其整合的镍离子量为9．3#mu#mol／mL，对His_6-BNP_10 的饱和吸附量为8．7mg／mL，稳定性良好。研究中发现的等温吸附线不符合Langmuir型吸附平衡方程，可用矩形吸附平衡关系描述，表明Ni-NTA树脂与His_6—BNP_10之间结合非常强烈。在利用自制柱料对His_6—BNP_10的纯化研究中，采用批次法，将咪唑梯度和pH梯度法两者结合，经一步纯化产物的纯度可达85％，收率为70％。

  亲合融合谷胱甘肽巯基转移酶制备重组人白细胞介素-6（Producing recombinant human interleukin-6 by affinity fusion with glutathione-S-Transferase）  

   作者:林锋 

   关键词:人白细胞介素-6,谷胱甘肽巯基转移酶,融合蛋白,亲合纯化

   摘要:将人白细胞介素-6(IL-6）表达为谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白的原始菌株 E.coli JM109，表达产物主要为无活性的包含体，包含体中的融合蛋白难以复性，不能用亲和纯化回收。从原始菌株中提取的表达质粒pHZ1818并转化入三种宿主大肠杆菌BL21、JM105和DH5#alpha#中，筛选到一株高效表达活性融合蛋白的菌株D207，本文对由该菌株表达和制备IL-6的工艺条件进行了系统的研究．D207菌株表达活性融合蛋白的优化培养条件是，在2xYTA培养基中，35 deg C培养至 OD_600为4.0,，降低培养温度至 30 deg C，2mg/L IPTG诱导 2小时，并保证诱导期通气良好．菌株表达产生的活性融合蛋白并非都以溶解状态 存在菌体细胞内，推测有大量活性融合蛋白以某种形式与细胞器或细胞膜结合．将离心收集的菌体重新悬浮于1X PBS，用 10ImM EDTA，2％Triton X-100处理30min，使菌体细胞完全破碎，将此细胞破碎液再于540W，50％超声处理10min，可使超过70％的活性融合蛋白溶解至破碎液的液相中．随后采用“半柱法”以 Glutathione Sepharose 4B亲和纯化细胞破碎液上清中的融合蛋白，洗脱液中每毫克融合蛋白加入凝血酶10IU，室温下酶切6小时，完全切除亲和标志GST，再将酶解液用 Q-Sepharose High Performance层析纯化，可以得到纯度超过95％的完整IL-6。按照上面确定的菌体培养、产物释放和纯化工艺，每升重组菌培养物可获得纯化的IL-6约4mg，其生物活性为9．7x10~7IU／mg，产量超过原始菌株结果的1倍以上，生物活性接近原始菌株的结果．

  重组人白细胞介素-6融合蛋白发酵工艺研究（Studies on Fermentation of Recombinant E .colo Containing Humn Interleukin-6 Fusion Protein）

   作者:胡飞雄 

   关键词:人白细胞介素-6融合蛋白发酵重组大肠杆菌

   摘要：本文系统的研究了重组大肠杆菌表达白细胞介素-6融合蛋白的发酵工艺条件。摇瓶实验中，确定了以含1 per thousand 葡萄糖的 2* YT培养基为最适合本菌种间歇发酵的培养基。同时，对诱导剂量进行优化，采用0.02mmoL／L的IPTG就能有效的诱导外源蛋白的表达，大大节约了成本。在10L发酵罐间歇实验中，以含1 per thousand 葡萄糖的 2*YT为培养基，得到的最优培养条件为：pH为6．75-7.0，接种量4％，温度37 deg C ，诱导前溶氧30％，在OD_600为1.2-1.8时诱导，诱导后控制溶氧为5-10％，诱导后培养5小时结束发酵。流加发酵中，尝试了两种培养基。在蛋白胨、酵母粉为主要能源的培养基中，采用仿指数流加，在OD_600为7．5左右诱导，控制诱导后比生长速率为0.15h~(-1)。以葡萄糖为主要能源的培养基，采用恒pH流加，可获得菌体湿重达60g/L，表达量为30％。

  重组人白介素-6纯工艺研究（Study of purification of the recombinant human interleukin-6 ）

   作者:陈旻  　

   关键词:重组人白介素-6,纯化,离子交换层析,疏水作用层析

   摘要：本文对人重组白介素-6(rhIL-6)的纯化工艺进行了研究 将表达rhIL-6的重组大肠杆菌细胞破碎，离心分离后得到包含体。所得包合作洗涤后，用含8M尿素的甘氨酸缓冲溶溶解变性，变性液经稀释复性，所得复性液为后续纯化过程原料液。分别研究了硫酸铁分级沉淀，DEAE弱阴离于、SP 阳离子、Q HighPerformance阴离于交换层析，Phenyl High Sub疏水作用层析和 Butyl疏水作用层析等分离方法对IL-6的分离效果。确定了经DEAE离于交换、Butyl疏水作用和Q High Performance离子交换层析的三步纯化路线。复性液经DEAE弱阴离于交换层析后，所得IL-6比活性为927*10_7u/mg，蛋白质量收率为34.1％。Butyl疏水作用层析可进一步除去疏水性较小的杂质，同时，rhIL－6活性有所提高，与复性液相比，该步所得 IL-6活性收率达 88．3％。用 Q High Performance层析对IL-6进一步纯化，所得最终产品在凝胶电泳上呈现单一条带，其纯度大于95％，比活性为2．75*10_8u／mg。经三步纯化后，rhIL_6总活性收率为74．8％，蛋白质量收率为 13．3％。考察了所确立纯化路线在半制备规模条件下对rhIL－6的纯化效果。在柱体积不变的前提下，复性液上样体积增至700ml，DEAE离于交换过程仍能保持较好的分高效率，rhIL-6收率无明显下降。但上样体积增加后，Butyl疏水作用层析分高效能下降，rhIL-6单步质量收率由 75％下降至 52％。Q High Performance离子交换层析在上样液体积增加后，rhIL-6纯度降低，不能得到单一条带的SDS凝胶电泳结果。制备规模下的rhIL_6纯化还需开展进一步的研究工作。

  重组人白细胞介素-6融合蛋白包含体的提取、洗涤及超声变性（The abstraction, washing and ultrasound denaturation of rhil-6 fusion protein inclusion bodies ）  

   作者:彭赞国 

   关键词:重组人白细胞介素-6,包含体,超声,高压匀浆

  人细胞介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达（Construction of human interlukin-6 plasmid and expression in saccharomyces cerevisiae）

   作者:宋磊 

   关键词:酿酒酵母,质粒构建,转化,表达

   摘要：本文将带有哺乳动物细胞信号肽的人白细胞介素－６（ｈＩＬ－６）基因片段构建到大肠杆菌－酵母细胞穿梭型载体质粒ｐＹＥＳ２中，获得表达质粒ｐＹＥＳ２－ｈＩＬ－６。同时使用四种不同的酿酒酵母细胞的转化方法进行了对比实验，从而找到酿酒酵母细胞最佳的转化条件为：４０％ＰＥＧ４０００、０．１ＭＬiＡｃ、０．０１Ｍ ＴＥ，并加入Ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（小牛胸腺ＤＮＡ），热冲击时间为２５ｍｉｎ 。另外，将表达质粒ｐＹＥＳ２－ｈＩＬ－６转化到酿酒酵母细胞ＤＢＹ７４７中，并将获得的转化在含２％乳糖的ＹＰ培养基中培养到ＯＤ_600＝１．０左右，后用２％的半乳糖进行了诱导表达。结果发现，在培养上清中的人白细胞介素-６的分泌量较低，而大量的表达蛋白存在于酵母细胞内。 

  基因工程人白细胞介素-6变性复性工艺研究（Study on denaturation and renaturation of recombinant human interleukin-6）

   作者:孙江莉 

   关键词:白细胞介素-6,变性,复性,谷胱甘肽

   摘要：本文较全面地研究了基因工程人白介素-6（rhIL-6）变性复性的工艺条件。通过对变性剂浓度、ｐＨ、蛋白浓度、变性复性时间等因素的研究，确定变性条件为：在50mmol/L的GIy-NaOH体系中（ph10.0），25mmol/L beta －ME，8mol/L脲，包涵体浓度为１０ｍｌ／ｍｌ，于37 deg C水浴变性４ｈ；复性的工艺条件为：用相同的缓冲液１０倍稀释，用ＨＡｃ调ｐＨ为7.0，于室温下复性１４ｈ左右，可获得较高的恬性，约为10~6Ｕ／ｍｇ。本文进一步讨论了复性工艺的改进方案，比较了梯度稀释复性和在复性液中分别加入Ｃｕ~(2+)、ＰＥＧ、谷胱甘肽、伴侣蛋白时的复性效果。结果表明Ｃｕ~(2+)和谷胱甘肽对于ｒｈＩＬ－６是较好的复性促进剂，活性可达10~7Ｕ／ｍｇ。本文采用了多种实验方法来研究ｒｈＩＬ－６的复性规律。除用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、测蛋白浓度等常用手段以外，还将细胞测活、ＨＰＬＣ以及ＤＴＮＢ等方法结合运用，并改进了细胞测活法，得到了精确的结果，取得了一定的进展。 

 重组大肠杆菌细胞破碎及人白细胞介素-6包含体纯化的研究（Study on disruption of recombinant escherichia coli and purification of human interleukin-6 inclusion bodies）

   作者:洪建辉 

   关键词:超声,高压匀浆,包含体,破碎动力学

   摘要:本文用超声对重组大肠杆菌细胞进行破碎以释放人白细胞介素－６包含体。对超声过程中的物理和化学因素，包括破碎时间，输出功率，菌体浓度，缓冲液ｐＨ值，菌体冻融及悬浮液体系做了系统的研究。确定了超声释放人白细胞－６包含体的工艺。首次使用高压匀浆机对重组大肠杆菌细胞进行破碎以释放人白细胞介素－６包含体。对高压匀浆过程中的物理和化学因素，包括匀浆次数，操作压力，进料温度，进料ｐＨ，以及悬浮体系的影响，做了系统的研究。本文还就匀浆破碎工艺与超声破碎工艺做了比较。用离心法对包含体的纯化工艺进行研究，初步选定了纯化人白细胞介素－６包含体的介质，纯化工艺。采用高速离心方法分离包含体。在实验基础上，对重组大肠杆菌细胞超声破碎及高压匀浆破碎的动力学进行了分析，建立了超声破碎及高压匀浆破碎重组大肠杆菌细胞的动力学模型。  

  基因工程人白细胞介素6发酵中试工艺研究(Studies on the pilot scale fermentation of recombinant human interleukin-6)　

   作者:陈祖华 

   关键词:指数流加,溶氧,比生长速率,表达量

   摘要:本文系统地研究了重组人白细胞介素６工程菌发酵的中试工艺条件，得到了两种培养方式下的最优条件，并给出了初步解决菌体浓度和异源蛋白质含量相互矛盾的方法。间歇发酵中，以２×ＹＴ作为培养基，接种量为2%，ｐＨ在7.0左右，诱导前溶氧水平在20%，温度在30 deg C，当ＯＤ_600达到1.6迅速升温到42 deg C诱导，控制溶液氧水平在10%，当溶氧水平开始上升且速度加快时，结束发酵。流加发酵中，首先确定了初始培养基和流加培养基的组成，仿指数阶跃流加，控制溶氧水平为10%，30 deg C下培养到ＯＤ_600为9.4左右，然后升温诱导，控制溶氧水平7%-10%，以溶氧水平开始上升作为结束标志，整个过程控制ｐＨ在6.9左右。诱导后适当的降低温度能在短时间内提高源蛋白质的百分含量，同时磷酸盐对于提高表达量了有极其重要的作用。发酵过程中控制菌体的比生长速率约为 0.15h~(-1)时能实现高菌体浓度和高表达量的统一和提高目的蛋白质收率。